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看完這篇文章你就了解核糖核酸酶的三個(gè)主要類別了

更新時(shí)間:2021-07-24      點(diǎn)擊次數(shù):3264

    核糖核酸酶,白色粉末。為具有球蛋白性狀的一種蛋白質(zhì)。溶于水、50%丙酮。此酶最適宜溫度為60℃,85℃以上失去作用,最適宜的pH值為7.6。是催化核糖核酸水解的一種核酸內(nèi)切酶,可使胞嘧啶核酸解聚。對(duì)胸腺核酸則無(wú)作用。用于生化研究。

    核糖核酸酶的分類:

    (一)核糖核酸酶A

    核糖核酸酶A(RNAseA)來(lái)源于牛胰臟,是一種內(nèi)切核糖核酸酶,可特異攻擊RNA上嘧啶殘基的3’端,切割胞嘧啶或尿嘧啶與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵,反應(yīng)終產(chǎn)物是3’嘧啶核苷酸和末端帶3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。無(wú)輔助因子及二價(jià)陽(yáng)離子存在時(shí),核糖核酸酶A的作用可以被胎盤(pán)RNA酶抑制劑(RNasin)或氧釩一核糖核苷復(fù)合物(vanadyl—ribonuclosidecomplex,VRC)所抑制。RNAseA的反應(yīng)條件極廣,且極難失活。在低鹽濃度(0~100mmol/lNaCl)下,RNAseA切割單鏈和雙鏈RNA、DNA:RNA雜交體中的RNA;當(dāng)NaCl濃度為300mmol/l?;蚋邥r(shí),RNAseA就特異性切割單鏈RNA。去除反應(yīng)液中的RNAseA,通常需要蛋白酶K處理、酚反復(fù)抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中,核糖核酸酶A的主要用途為:

    ①?gòu)腄NA:RNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。

    ②確定RNA或DNA中的單堿基突變的位置。在RNA:DNA或RNA:RNA雜交體中,若存在單堿基錯(cuò)配,可用RNAseA識(shí)別并切割。通過(guò)凝膠電泳分析切割產(chǎn)物的大小,即可確定錯(cuò)配的位囂。

    ③RNA檢測(cè)。RNA酶保護(hù)分析法(RNAseprotectionassay)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)RNA的雜交技術(shù)。其基本原理是利用單鏈RNA探針,與待測(cè)的RNA樣品進(jìn)行雜交形成RNA:RNA雙鏈分子,由于RNA酶可專一性地降解未雜交的單鏈RNA,而雙鏈?zhǔn)艿奖Wo(hù)不被降解,經(jīng)凝膠電泳可以確定目的RNA的長(zhǎng)度。該方法靈敏度較Northern雜交法更高,并可進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量。選擇適當(dāng)?shù)奶结?,還可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析及內(nèi)含子(也稱內(nèi)元)剪切位點(diǎn)分析等研究。此法的靈敏度比核酸酶S1保護(hù)分析法高數(shù)倍。

    ④降解DNA制備物中的RNA分子。須使用無(wú)DNAsd的RNAse(DNaseIfreeRNAse),市售的一般RNAseA常含有DNAse,可在100retool/ITris—CI(pH7.5)和15mmol/l。NaCI溶液中100℃加熱15min,以去除之。

    (二)核糖核酸酶T1

    核糖核酸酶T1(RNAseT1)來(lái)源于米曲霉(Aspergillusorjzae),它特異地作用于鳥(niǎo)嘌呤3’端磷酸,切割位點(diǎn)在鳥(niǎo)嘌呤的3’磷酸和相鄰核苷酸的5‘羥基之問(wèn)的磷酸二酯鍵,反應(yīng)終產(chǎn)物為3’鳥(niǎo)苷酸和末端帶3’鳥(niǎo)苷酸的寡核苷酸片段。RNAseTl的反應(yīng)條件極廣,且極難失活,其催化活性類似于RNAseA。

    在RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,RNAseT1與RNAseA聯(lián)合使用,對(duì)RNA進(jìn)行定量和作圖;還可用于去除DNA:RNA雜交體中未雜交的RNA區(qū)。

    (三)核糖核酸酶H

    核糖核酸酶H(RNAseH)最早是從小牛胸腺組織中發(fā)現(xiàn)的,其編碼基因已被克隆到大腸桿菌中。它能特異地降解DNA:RNA雜交雙鏈中的RNA鏈,產(chǎn)生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和單核苷酸,它不能降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。

    在分子克隆中,核糖核酸酶H的主要用途是與大腸桿菌DNA聚合酶工和DNA連接酶一起參加cDNA克隆中第二條I)NA互補(bǔ)鏈的合成。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA第一鏈之后,用RNAseH部分消化mRNA:DNA雜交分子中的RNA,產(chǎn)生的RNA片段就像岡崎片段一樣,作為大腸桿菌DNA聚合酶T的引物,以cDNA第一鏈為模板合成DNA,直到把mRNA全部代替。然后在DNA連接酶的作用下,封閉缺口形成雙鏈cDNA。
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